非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳:

1 儀器：垂直系列電泳槽；低、中、高壓電源；恒溫循環(huán)器

2 試劑： 丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、TEMED、 考馬斯亮藍(lán)\硝酸銀、凝膠緩沖液、非變性上樣緩 沖液、Tris堿、甘氨酸等

聚丙烯酰胺凝膠電泳

變性聚丙烯酰胺凝膠電泳 1 儀器：垂直系列電泳槽；低、中壓電源、恒溫循環(huán)器 2 試劑： 丙烯酰胺、N,N’-甲叉雙丙烯酰胺， SDS（ 十二烷基硫 酸鈉）溶液、1.5MTris-HCl(pH8.8）、0.5MTris- HCl(pH6.8）、TEMED、10%(w/v)過硫酸胺溶液、SDS- Page上樣緩沖液:（ 0.5M Tris（ pH6.8）緩沖液、甘油、 10%SDS 、二硫蘇糖醇、溴酚藍(lán)）、Tris、甘氨酸、SDS 、考馬斯亮藍(lán) \硝酸銀等

SDS-Page，在蛋白質(zhì)裂解液中加入 SDS和疏基乙醇或DTT

巰基乙醇或DTT可使蛋白質(zhì)分子中二硫鍵還原，使多肽分成單個亞單位。

SDS-PAGE時，在蛋白質(zhì)裂解液中加入SDS和疏基乙醇或DTT

PAGE據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)

連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷及分子篩效應(yīng)； 不連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中由于緩沖液離子成分、pH、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng)、分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，故分離效果更好。 不連續(xù)的聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)，利用凝膠層的不連續(xù)性、緩沖液離子的不連續(xù)性、PH的不連續(xù)性及電位梯度的不連續(xù)性，使樣品在不連續(xù)的兩相間積聚濃縮成很薄的起始區(qū)帶，然后進行分離。

樣品濃縮效應(yīng)

1） 凝膠孔徑的不連續(xù)性： 濃縮膠為大孔膠；分離膠為小孔膠。在電場作用下，樣品顆粒在 大孔膠中泳動的阻力小，移動速度快；當(dāng)進入小孔膠時，受到的阻 力大，移動速度減慢。因而在兩層凝膠交界處，樣品遷移受阻而壓 縮成很窄的區(qū)帶。

2） 電位梯度的不連續(xù)性： 電泳開始后，快離子的快速移動會在其后形成一個離子強度很低 的低電導(dǎo)區(qū)，使局部電位梯度增高，將蛋白質(zhì)濃縮成狹窄的區(qū)帶

緩沖體系離子成分及pH值的不連續(xù)性

 

 

 

Tris:緩沖配對離子，維持溶液的電中性及pH值 Cl-: 在電場中遷移率快，前導(dǎo)離子(leading ion)，快離子。 Gly:其pI =6.0，在pH6.8的濃縮膠緩沖體系中，甘氨酸解離度很小，因而在 電場中遷移很慢，稱為尾隨離子（trailing ion），慢離子。當(dāng)進入 pH8.8的分離膠時，甘氨酸解離度增加，其有效遷移率超過蛋白質(zhì);因此 Cl-及NH2CH2COO-沿著離子界面繼續(xù)前進。高電勢梯度不存在了，各種蛋 白質(zhì)僅會由于其分子量或構(gòu)型的不同，在一個均一的電勢梯度和pH條件 下通過一定孔徑的分離膠時所受阻滯的程度不同，表現(xiàn)的泳動率的不同 被分開 大多數(shù)蛋白質(zhì)在pH6.7或8.3時均帶負(fù)電荷，在電場中，都向正極移動。

分子篩效應(yīng)

大小和形狀不同的蛋白質(zhì)通過一定孔徑分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率 ，這就是分子篩效應(yīng)。

電荷效應(yīng)

蛋白質(zhì)樣品在界面處被濃縮成一狹窄的高濃度蛋白質(zhì)區(qū)，但由于每種蛋白質(zhì)分子所帶有效電荷不同，因而泳動率也不同，因此各種蛋白質(zhì)就按泳動率快慢順序排列成一個一個區(qū)帶。在進入分離膠時，電荷效應(yīng)仍起作用。 目前，PAGE連續(xù)體系應(yīng)用也很廣，雖然電泳過程中無濃縮效應(yīng)，但利用分子篩及電荷效應(yīng)也可使樣品得到較好的分離，加之在溫和的pH條件下，不致使蛋白質(zhì)、酶、核酸等活性物質(zhì)變性失活，也顯示了它的優(yōu)越性。

PAGE電泳據(jù)電泳裝置不同分為圓盤及垂直的板狀兩種

前者凝膠是在玻璃管中聚合，樣品分離區(qū)帶染色后呈圓盤狀，因而稱為圓盤電泳； 后者凝膠是在兩塊間隔幾毫米的平行玻璃板中聚合，故稱為垂直板狀電泳。兩者電泳原理完全相同。

蛋白質(zhì)進行PAGE時，常用垂直板電泳。

垂直板電泳的優(yōu)越性有：

表面積大而薄，便于通冷卻水以降低熱效應(yīng)，條帶更清晰。

在同一塊膠板上可同時進行10個以上樣品的電泳，便于在同一條件下比較分析鑒定，還可用于印跡轉(zhuǎn)移電泳及放射自顯影。

膠板制作方便，易剝離，樣品用量少，分辨率高，不僅可用于分析，還可用于制備。

膠板薄而透明，電泳染色后可制成干板，便于長期保存與掃描。

可進行雙向電泳。